摘要

朱砂根作为典型的园林观赏药用植物，无论是从观赏价值和药用价值角度考虑，还是从生态用途以及经济价值角度考虑，都极具开发利用的潜力。本文较系统的研究了朱砂根无菌快繁技术、发根诱导的条件优化及检测、发根中三萜皂苷含量的测定。研究结果如下：

1、通过对朱砂根4种外植体进行无菌培育，得到了以下结论：

（1）选用朱砂根当年生带芽茎段、基部萌条、2月苗龄实生小苗、当年结实种子4种外植体进行无菌培养，基部萌条和当年结实种子是最理想的外植体材料，污染率和褐化程度低。采用0.1%升汞连续2次消毒，基部萌条和2月苗龄实生小苗最适消毒时间是（3+3）min，而当年结实种子和带芽茎段最适消毒时间则是（4+4）min。

（2）朱砂根4种外植体最适生长培养基为MS培养基，最佳芽诱导培养基组合是MS + TDZ 0.1 mg/L+ NAA 0.1 mg/L，而最佳芽增殖培养基组合是MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L + TDZ 0.05 mg/L。

2、选用A 4、ATCC 15834、LBA 9402、R 1601四种供试发根农杆菌侵染朱砂根无菌外植体幼叶（近似1 × 1 cm2）、幼茎（约1 cm长）诱导毛状根，并对发根农杆菌进行抗性筛选和生长曲线绘制，进行共培养和预培养时间以及侵染方式等筛选，比较不同发根农杆菌和不同外植体的发根诱导率等。首次用发根农杆菌侵染朱砂根并获得了毛状根，初步建立了朱砂根发根诱导体系。其研究结果如下：

（1）对发根农杆菌进行抗性筛选，A 4、ATCC 15834最适宜在YMB + Rif 50 mg/L培养基上生长，而LBA 9402、R 1601最适宜在YMB + Amp 50 mg/L培养基上生长。在菌株活化过程中，LBA 9402、ATCC 15834、A 4、R 1601分别进行液体培养8～10 h、11～13 h、12～14 h、12.5～14 h就可达到OD600值0.5～0.8，此时为菌株的生长对数期，是进行侵染的最佳时期。

（2）在朱砂根发根诱导过程中，1/2MS培养基是发根诱导的最适培养基；在1/2MS培养基上预培养2 d、1/2MS + AS 100 μmol/L培养基上共培养2d可以提高诱导率；将剪好的幼叶和活化好的菌液（+ AS 100 μmol/L）一起在恒温摇床中28 ℃、180 r/min黑暗共振荡8～15 min诱导效果最好；除菌培养基选用1/2MS + Cef，每7d更换一次培养基，Cef浓度依次减小（500 mg/L、400 mg/L、300 mg/L、200mg/L、100mg/L、0 mg/L）；无菌幼叶是朱砂根发根诱导的最佳外植体选择；4种菌株均能够诱导朱砂根幼叶毛状根产生，但A 4、ATCC 15834是最有效的侵染菌株，其致根能力大小顺序为ATCC 15834 > A4 > LBA 9402 > R 1601。

（3）对发根进行直观的形态特征观察和记录以及PCR分子检测，发根农杆菌ATCC 15834、A 4菌株Ri质粒上的T-DNA已成功转移并整合到了朱砂根幼叶细胞核基因组中。

3、采用RP-HPLC（反相高效液相色谱）法对发根农杆菌ATCC15834介导朱砂根幼叶产生的发根进行三萜皂苷含量检测。结果表明，发根中三萜皂苷含量为8.21%， 而CK（组培根）组含量为0.18%，被介导的外植体（无菌叶片）含量为0.79%。通过介导得到的发根中，其三萜皂苷的含量显著高于对照组和宿主细胞中的含量，此结果符合发根中次生代谢产物比原植株中含量高的规律。

关键词：朱砂根，发根农杆菌，毛状根，三萜皂苷

摘要

朱砂根作为典型的园林观赏药用植物，无论是从观赏价值和药用价值角度考虑，还是从生态用途以及经济价值角度考虑，都极具开发利用的潜力。本文较系统的研究了朱砂根无菌快繁技术、发根诱导的条件优化及检测、发根中三萜皂苷含量的测定。研究结果如下：

1、通过对朱砂根4种外植体进行无菌培育，得到了以下结论：

（1）选用朱砂根当年生带芽茎段、基部萌条、2月苗龄实生小苗、当年结实种子4种外植体进行无菌培养，基部萌条和当年结实种子是最理想的外植体材料，污染率和褐化程度低。采用0.1%升汞连续2次消毒，基部萌条和2月苗龄实生小苗最适消毒时间是（3+3）min，而当年结实种子和带芽茎段最适消毒时间则是（4+4）min。

（2）朱砂根4种外植体最适生长培养基为MS培养基，最佳芽诱导培养基组合是MS + TDZ 0.1 mg/L+ NAA 0.1 mg/L，而最佳芽增殖培养基组合是MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L + TDZ 0.05 mg/L。

2、选用A 4、ATCC 15834、LBA 9402、R 1601四种供试发根农杆菌侵染朱砂根无菌外植体幼叶（近似1 × 1 cm2）、幼茎（约1 cm长）诱导毛状根，并对发根农杆菌进行抗性筛选和生长曲线绘制，进行共培养和预培养时间以及侵染方式等筛选，比较不同发根农杆菌和不同外植体的发根诱导率等。首次用发根农杆菌侵染朱砂根并获得了毛状根，初步建立了朱砂根发根诱导体系。其研究结果如下：

（1）对发根农杆菌进行抗性筛选，A 4、ATCC 15834最适宜在YMB + Rif 50 mg/L培养基上生长，而LBA 9402、R 1601最适宜在YMB + Amp 50 mg/L培养基上生长。在菌株活化过程中，LBA 9402、ATCC 15834、A 4、R 1601分别进行液体培养8～10 h、11～13 h、12～14 h、12.5～14 h就可达到OD600值0.5～0.8，此时为菌株的生长对数期，是进行侵染的最佳时期。

（2）在朱砂根发根诱导过程中，1/2MS培养基是发根诱导的最适培养基；在1/2MS培养基上预培养2 d、1/2MS + AS 100 μmol/L培养基上共培养2d可以提高诱导率；将剪好的幼叶和活化好的菌液（+ AS 100 μmol/L）一起在恒温摇床中28 ℃、180 r/min黑暗共振荡8～15 min诱导效果最好；除菌培养基选用1/2MS + Cef，每7d更换一次培养基，Cef浓度依次减小（500 mg/L、400 mg/L、300 mg/L、200mg/L、100mg/L、0 mg/L）；无菌幼叶是朱砂根发根诱导的最佳外植体选择；4种菌株均能够诱导朱砂根幼叶毛状根产生，但A 4、ATCC 15834是最有效的侵染菌株，其致根能力大小顺序为ATCC 15834 > A4 > LBA 9402 > R 1601。

（3）对发根进行直观的形态特征观察和记录以及PCR分子检测，发根农杆菌ATCC 15834、A 4菌株Ri质粒上的T-DNA已成功转移并整合到了朱砂根幼叶细胞核基因组中。

3、采用RP-HPLC（反相高效液相色谱）法对发根农杆菌ATCC15834介导朱砂根幼叶产生的发根进行三萜皂苷含量检测。结果表明，发根中三萜皂苷含量为8.21%， 而CK（组培根）组含量为0.18%，被介导的外植体（无菌叶片）含量为0.79%。通过介导得到的发根中，其三萜皂苷的含量显著高于对照组和宿主细胞中的含量，此结果符合发根中次生代谢产物比原植株中含量高的规律。

关键词：朱砂根，发根农杆菌，毛状根，三萜皂苷